蛋白芯片技术

华盈视角:蛋白芯片检测技术解答(FAQ)

2019/05/29

1. 磷酸化芯片如何设置阈值筛选差异?FC>1.2是否算有意义的改变?

FC的设置在业界没有固定的设置要求,我们是根据一些参考文献及磷酸化调变在总磷酸化蛋白中的占比进行预设的阈值。一般情况下会以1位临界,大于1的认为是磷酸化水平上调,小于1的为磷酸化水平下调,但实际上是不需要这么假设。检测磷酸化上调或下调,具体选择怎样的调变倍数进行cutoff,需要根据具体的实验设计,参考文献来进行选择。国际上同行多数是将比值变化进行排序,从两头往中间看(当然调变越大相对参考性越大),根据结果与实验的解释能一致的地方作为阈值考虑。

 

2. 为什么芯片上的抗体位点和文献报道的不一样,能用吗?

芯片上的很多磷酸化位点没有把第一个起始氨基酸Met计算在内,所以会比实际的小1。只要氨基酸前后序列是对的,就没问题的。

 

3. 磷酸化抗体芯片,即使是同个蛋白,也有不同位点的上调/下调?

同一个蛋白不同位点的磷酸化状态改变,可能功能是不同的,有些甚至可能是相反的。具体的位点磷酸化水平改变对于其生理功能有何影响,请您参考网站http://www.phosphosite.org来进行查询。

 

4. 芯片实验结果与WB结果不一致,该如何理解?

1)这个差异也许与检测手段不同相关,芯片用的蛋白为非变性蛋白,和WB有所差别;芯片的杂交体系为抗体捕获抗原,与WB的抗原转膜后与抗体孵育也稍有差别,因此也许会造成部分差异;
2)需要客户提供WB验证的结果图,以便我们更好的分析分析客户验证的指标在芯片上的图像和数据情况;
3)芯片数据分析有业内约定俗称的规定,保证了芯片数据和芯片产业的基本运行。不同技术平台的数据和参数技术原理不同,因此,需要理解蛋白高通量技术的特点,即尽可能多的筛选到有用的数据而不是保证每个数据都完美。
4)磷酸化芯片中的抗体识别磷酸化位点周围的特定残基。磷酸化抗体仅在蛋白质被磷酸化时才检测蛋白质。非磷酸抗体检测总蛋白质。芯片测定中使用的蛋白质未变性,因此保留了它们的3D折叠结构。因此,只有当特定残基暴露并可用于结合时,蛋白才被抗体识别。如果未检测到样品中的某些蛋白质,通常是因为无法获得结合残基。另一方面,蛋白质在磷酸化后立即与另一种蛋白质形成复合物。这种现象可以阻止磷酸化位点被抗体识别; 结果,没有检测到蛋白质。

 

5. 芯片上的抗体是针对人的吗?能不能用作其它物种的检测?

磷酸化位点具备保守性,芯片上的抗体都是以目标蛋白的物种保守多肽序列

为抗原进行设置,所以,具有物种通用性。已经成功进行了鸡和线虫样本实验。对于特殊样本,可以做一个样本的预实验,需要额外收取一定费用。但需要注意的是,预实验的芯片和正式实验芯片上的指标是不一样的,只是评价这个样本能否做抗体芯片,对背景有无影响等。

 

6. 为什么做相互作用蛋白筛选时,质谱打到300多个,而20k芯片显示的结合却很少?

芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白,可以保证每种蛋白的丰度。芯片实验容易发现潜在的结合蛋白。芯片是固定的蛋白点,每个点是相互独立的,保证筛选到的互作蛋白均为目标蛋白的直接结合蛋白。而质谱不能区分是否是直接结合蛋白,鉴定到的蛋白很可能大部分是间接结合的。另外,质谱与20K芯片的检测原理不同,也会带来数据不匹配的可能。如果您有两套数据,可以兼顾两种技术的特点,综合分析,具体方法可以参见我们客户的文章(Shen SM, et al. Nuclear PTEN safeguards pre-mRNA splicing to link Golgi apparatus for its tumor suppressive role. Nat Commun. 2018 Jun 19, 9(1): 2392.)。

 

7. 20K做小分子靶点筛选比pulldown+MS的优势?

1) 芯片实验为体外实验,芯片上每个蛋白点相互独立,保证筛选到的互作蛋白均为目标蛋白的直接结合蛋白,数据分析简单;pull down-LC/MS检测到的是与小分子有结合的蛋白复合物,不一定是直接结合的蛋白。
2)pulldown使用细胞内的蛋白进行检测,要看拉下来的蛋白量的多少,太少的话质谱不一定能打出来。
3)在不同组织、细胞、细胞器中,蛋白的表达丰度差异很大,传统的CO-IP等实验很难发现低丰度蛋白,人类蛋白组芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白,可以保证每种蛋白的丰度,芯片实验容易发现潜在的结合蛋白。
4)利用人类蛋白组芯片实验筛选互作蛋白,从蛋白质层面分析互作数据,避免了CO-IP后质谱鉴定时,从多肽水平跨层分析互作蛋白的不确定性和复杂性。

 

8. 做小分子靶点筛选的对照怎么选?

生物素对照:一般是D型生物素,分子量一般是244.31,如果有其他修饰,

分子量会发生变化。

 

9. 为什么20K芯片要用红色荧光Cy5?

20K上的蛋白有部分会自发绿色荧光,同时Cy3荧光标记芯片背景也较高,所以20K芯片实验一般用 Cy5标记样品。