蛋白质谱技术

华盈视角:蛋白质谱检测技术解答(FAQ)

2019/05/29

1. 质谱仪器有哪些型号和种类?各项目类型有专门的仪器吗?

目前有:Q-TOF、Orbitrap Elite、QE、QE plus、QE HFx、Fusion Lumos,从Q-TOF至Lumos精度和分辨率依次增加,蛋白组鉴定结果也递增。

仪器不固定,需要考虑各平台机时问题。如果项目周期较严格,我们不能保证仪器种类。

华盈生物的定量蛋白组服务会优先采用QE plus及更高灵敏度的仪器。

2. label free、iTRAQ/TMT、胶条鉴定项目的时间周期分别是多少呢?

label free     3-5周;

iTRAQ/TMT   5-7周;

胶条鉴定     2-3周;

磷酸化蛋白组  5-7周。

3. 蛋白鉴定的修饰分析只提供3种特定的分析吗?是否可以鉴定磷酸化、乙酰化等其他修饰?结果中是否可以看到哪一个氨基酸发生了修饰?

1)3种常规修饰:氧化,烷基化,乙酰化。

2)一般磷酸化、泛素化前期需要做富集,自然状态下的磷酸化、乙酰化的量非常少,串联质谱根据母离子的丰度选取 topN 进行二级碎裂来检测,若前期不进行富集,最终鉴定到的磷酸化、乙酰化肽段可能不多。若客户不做富集,只在搜库时加搜修饰,则最多接受6种修饰,且涉及收费,500元/例。磷酸化富集方法有TiO2富集、PTMscan等,

目前华盈可接磷酸化蛋白组的相对定量蛋白组质谱分析。

3)多肽信息表中(peptide)包含具体哪一个氨基酸位点发生了修饰。

4. iTRAQ/TMT标记定量质谱实验中, 分10个组分(fraction)和20个组分(fraction)上样检出结果有多大区别?上机1h和2h大约有多大差别?

理论上来讲,分的fraction越多,打到的蛋白种类会越多,打的时间越长,也会越多,但不是直接的线性关系。因为质谱检测过程中,会在一级选取topN离子进行二级碎裂检测,一个fraction对应一次上样,分的fraction越多,时间越长,选取的top N次数会越多,所以被分析的蛋白会越多。

5. 多批次标记定量质谱如何设计实验?客户样本为四组,每组三例,共计12例样本,怎么设计实验?
做两套iTRAQ,每套安排6例样本+1例pool样,7标。尽量安排2套中有所有组的样本,比如:a1+b1+c1+d1+a3+b3+pool,a2+b2+c2+d2+c3+d3+pool。多批次中的pool样建议是多个样本的混样,且各批次pool样一致,理论上pool样鉴定蛋白种类应该最多,用于批次间数据校正。

6. iTRAQ/TMT预实验指的是什么,预实验和正式实验的关系?

预实验包括:所有样本的蛋白浓度测定,以及SDS-PAGE跑胶、取少数样本进行酶解质控,酶解效率是否达到质控标准,预实验包含于正式实验中,正式实验是包括预实验到标记以及后续上机鉴定的所有实验。

7. 蛋白制样的过程当中是否加磷酸酶和蛋白酶抑制剂 cocktail?

需要加,加蛋白酶抑制剂防止蛋白被降解,加磷酸酶抑制剂防止磷酸化的丢失。

8. CoIP/IP/Pulldown产物跑胶的时候用银染还是考染?

两种都可以。一般产物比较少,银染灵敏度较高,推荐银染。考染灵敏度低,未出现条带处也可能鉴定到蛋白。

9. 客户需要质谱图,是否可以提供?

两种方案供客户选择:1)提供原始数据,可以自己拿回去用专业软件读取查找。2)3张以内的可以找,超过部分100元一张。

10.  Label free如何校正样本?用内参吗?

不设置内参。Labelfree数据采用Maxquant软件搜库,在搜库时,软件的MaxLFQ算法会对样本进行校正,以消除处理、上样、仪器等造成的样本间误差。参考文献:[Cox Jürgen,Hein Marco Y,Luber Christian A et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.[J] .Mol. Cell Proteomics, 2014, 13: 2513-26.]