外泌体研究

华盈视角:外泌体研究常见问题解答(FAQ)

2019/05/29

1.华盈生物外泌体服务体系有哪些优势?

华盈生物是中国国内做外泌体研究服务标杆性的企业,在外泌体服务领域,华盈生物具备几个独特的优势:

1)公司技术部门高层是中国中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会外泌体技术专家委员会的专家委员,是《外泌体研究、转化和临床应用专家共识》的制定者之一,与国际外泌体主流科学家团队始终保持密切沟通。

2)华盈生物技术服务体系非常完整,包括:外泌体制备、外泌体鉴定、外泌体内容物筛选、外泌体标志物验证等一套完整的技术流程,客户可以获得一站式服务体验。

3)华盈生物技术平台非常丰富(包括超离、尺寸排阻色谱、TRPS、NTA、质谱、抗体芯片、测序、基因芯片、数字PCR、Simoa等),在研究的每个技术环节,根据研究人员的现有条件和下游实验需求,为其提供较为合适的技术选择,以帮助研究人员更好的达到实验目的。

4)华盈生物的技术团队经验丰富,研发能力强大,不仅完成了多物种(人、大鼠、小鼠、猪、细菌),多样品类型(血清、血浆、卵泡液、精浆、唾液、尿液、脑脊液、房水、细胞上清:肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、单核细胞、肝巨噬细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞)的外泌体研究服务,而且还自主开发了EIQ3外泌体提取试剂盒,市场口碑优秀。

5)华盈生物在外泌体业务上投入大,产品丰富,不仅有一站式服务体系,还提供尺寸排阻色谱柱(SEC)、EIQ3外泌体提取试剂盒、118彩票、无血清培养基、外泌体marker特异抗体、外泌体染料、TRPS外泌体粒径分析仪,外泌体自动收集仪等丰富的仪器设备,打造了一个外泌体研究的综合平台。

2. 外泌体研究中的细胞培养,能否先用正常培养液养到70%再换118彩票的培养液? 

有些文章中确实会使用无血清培养液培养细胞然后收上清分离外泌体的方法,该方法是使用含有外泌体的血清培养细胞到一定密度,然后移除培养液,使用1×PBS清洗数次之后换无血清培养液进行培养即可。但是目前很多高分文章基本都是直接使用118彩票的培养液进行细胞培养的。

 

3. 外泌体研究中的细胞培养,能否用无血清培养液培养?

推荐用含有118彩票的培养液培养细胞,如果条件有限,可以考虑先将细胞使用有外泌体血清培养,细胞长到一个合适的密度如70%-80%左右时,移除培养液,37℃预热的PBS清洗细胞3-5遍,换无血清的培养液,收集培养上清,分离外泌体。

4.哪种外泌体的分离纯化方法比较好?

选择分离纯化的方法主要依据下游实验综合考量。如果是血清或血浆样品,如果下游研究涉及蛋白组学实验,对外泌体中高丰度脂蛋白的去除非常必要,推荐使用尺寸排阻色谱法(SEC)。对于核酸实验,则可选方法较多,但要考虑样品量与外泌体的得率之间的关系,核酸实验普遍要求的外泌体量较蛋白组学实验大,如果即样品量充足,可以选择超速离心或者SEC方法。如果样品量少于1ml,建议选用聚合物沉淀法。每种方法均有优缺点,现举例比较一下:

1)超速离心法:方法经典,需要特殊仪器设备,操作繁琐,技术难度高,操作重复性差,耗时长,外泌体纯度较高,但脂蛋白去除效果差;

2)聚合物沉淀法:操作简便,技术难度低,耗时短,外泌体纯度低,得率高;

3)尺寸排阻色谱法(SEC):高丰度蛋白HDL、LDL去除效果好,外泌体纯度高,得率相对低,重复性好,易标准化操作;

 

5.外泌体标志物鉴定用哪个marker做WB好?

根据外泌体相关文献的统计,排在前4位的检测指标为CD63、TSG101、 CD9和CD81并列第三位;接着检测较多的4个指标为Alix、 HSP70、 flotillin和Syntenin;此外还有一些指标仅少数文献中出现过,例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT等。

针对外泌体的定性检测建议选择3个阳性指标CD9  CD81  CD63,以及1个阴性指标calnexin。

6.外泌体蛋白做WB用什么内参基因?

目前大部分文献中没有检测内参基因,个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测,从文献调研结果来看,外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低,Western blot检测时可能会检测不到任何条带或者条带微弱。因此,更多的是用等蛋白定量校准样品间的差异。

7.外泌体研究时,一般用血浆还是血清?

外泌体研究最好使用血浆样本进行实验。血清是在血液凝固之后收集的液体,其中少了纤维蛋白原,凝血因子,以及多了很多凝血产物。有研究发现,在凝血过程中血小板会分泌大量外泌体,而血清中有接近50%的外泌体来源于这些额外的分泌;同时,血清凝固时会形成纤维网,将本来血液中的外泌体包裹在凝血块中。这一正一反,就导致血清中的外泌体与常规疾病之间的关联性低于血浆。另外,血浆=血液-血细胞 ;血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子。所以在特殊情况下,如果研究与血小板相关的疾病的时候,血清反而更适合。

8.外泌体Western blot鉴定时通常使用哪些公司的抗体?

文献报道较多的两个公司Abcam和Santa Cruz (sc-5275),目前SBI公司的抗体也比较多。目前文献报道的其他公司还有ImmunoWay、Systems Biosciences Inc、Abnova、BD Pharmingen 、Thermo Pierce、Sigma-Aldrich、Systems Biosciences Inc等。

9.外泌体常见的研究方向

外泌体的研究主要包括三个方向:

1)疾病机理/耐药研究:主要研究外泌体作为细胞间的摆渡车,介导细胞间通讯和在免疫方面起作用,属于微环境研究的范畴。

2)标志物研究:主要研究外泌体种类、数目、大小和内含物与疾病之间的关系,对外泌体中的蛋白、核酸进行定量,以作为疾病的biomarker,其可预测疾病的发生与进展。

3)药物研究:在靶向药物的研究中,外泌体可作为载体可将包裹在其内的药物运送到目标区域。

10.分离细胞培养上清中的外泌体需要多少体积上清?

细胞培养上清使用量取决于细胞系类型和细胞的状态。一般来说干细胞分泌外泌体能力普遍较强,如间充质干细胞(MSC)。用超离分离外泌体,第一次摸索条件,起始细胞上清体积最好50ml以上,试剂盒法起始量最好10ml以上。根据摸索实验结果结合下游实验外泌体用量采用相应的上清体积。

 

11.分离血清&血浆中的外泌体研究需要多少样本体积?

根据下游实验外泌体用量,选用不同的样本体积和方法。一般情况由于血清血浆样本中外泌体的含量相对较高,完成一次蛋白组学实验,试剂盒法所需样本起始体积建议>200ul。排阻色谱柱法所需样本起始体积建议>500ul,而超速离心法所需样本起始体积建议>2ml之间。其他实验需进行预实验探索,与下游检测技术也有关系,一般基因芯片的样本用量要少于测序。

12.为什么超离后看不到外泌体沉淀?

这种问题通常有三种可能性,其一:样本体积少,外泌体量少,得率低,从而造成了这样的结果。其二:使用了不透明的超速离心管,一般来说外泌体产量都比较小,所以凡是不透明的管子,基本都是很难见到明显沉淀。其三:部分品牌离心机的角转管壁粘附性很低,超离结束没多久沉淀就会滑落下去,所以在离心结束时需要尽快收样。


13.外泌体电镜是不是一定要有膜结构,无膜结构的球体对不对?

答:  负染电镜结果中外泌体的形态理想状态下应该呈现明显的茶托状!边缘有一圈略微更明亮的亮圈。无膜结构的圆球形,很可能是脂蛋白颗粒(LDL)或者抱团的蛋白质。


14.待提取外泌体的细胞培养液如何保存,外泌体样品又如何保存?

根据一些方法学相关文献的报道。细胞培养液最好收集好后尽快分离其中的外泌体。两三天的话只需要放在4°即可,不建议长时间保存培养液。外泌体样品最好分离纯化后直接使用,不要进行冻融,短时间两三天放4°可以。如果需要保存时间超过7天以上,最好保存在-80°内。


15. 为什么会选择CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX等作为外泌体或者外泌体的标志物。

这些蛋白标志物其实最初是通过纯化外泌体然后通过质谱分析发现的存在于外泌体的一些高丰度蛋白,因此也就开始逐渐将他们作为外泌体标志物。CD63、CD9、CD81三个蛋白都是四次跨膜蛋白家族的成员,直接参与了外泌体内容物的分选,TSG101是ESCRT复合体相关的蛋白,ALIX直接涉及到了囊泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的过程。

16.外泌体标志性蛋白是外泌体上独有的么?

不是。这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程,多数是膜蛋白或者是ESCRT复合体成员及其相关蛋白,他们产生于细胞中,定位于胞内的膜结构附近,因此细胞中自然也会存在。只是因为外泌体的形成依赖于这些分子,因此这些分子在囊泡中发挥功能,因此在囊泡中丰度要明显比细胞中更高一些。


17.为什么外泌体鉴定要做NTA测粒径分布、电镜看形态、WB检测标志蛋白三个实验?

答:  目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品,而且没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。

比如超速离心和凝胶排阻层析都不能很好地去除血清中脂蛋白颗粒,即使使用梯度密度离心也是一样。所以需要三项鉴定来确定纯化的产物为外泌体。

再来看三种方法,电镜可以看到形态,但是包括支原体、铁蛋白聚团、溶酶体等它们形态很类似; NTA是一种测算粒子群体直径分布和数量的计算方法,而观测靠的是粒子对光路的影响,这一方法不能反映粒子形态,无论样品是外泌体还是纳米微珠,它都会算作粒子,因此也不能区分外泌体;WB是鉴定的是外泌体的一些标志物蛋白,但是目前的这些标志物蛋白只是会在外泌体里富集,而并不是外泌体所特有的,诸如CD63、ALIX等在细胞中都有,在一些细胞碎片、溶酶体、胞内体中也大量存在。因此需要三种方法共同进行相互验证。

18.外泌体样品如何定量?

目前外泌体的定量方法主要有三种:

1)通过BCA等方法对分离得到的外泌体进行蛋白定量,用测得的蛋白量来反映外泌体的量。

2)通过纳米粒子计数仪对外泌体的粒子数进行计算,使用粒子数目来反映外泌体的数量。

3)使用外泌体表面特定的某一个标志物的ELISA定量数据来反映外泌体的数量,比如使用CD63 CD81等。

对于定量方法的选择,三者选一即可,论文前后保持一致即可。BCA定量容易有杂蛋白影响、纳米粒子计数也存在一定的误差、ELISA分析的外泌体蛋白通常在其他膜结构和游离系统中都会有。

19.外泌体的网站有哪些

1) EVpedia数据库(http://www.evpedia.info/);外体蛋白质组、转录组和脂质体

2) ExoCarta数据库(www.excarta.org/);外泌体蛋白质、RNA和脂质体

3) Vesiclepedia 数据库(javascript:;)囊泡蛋白质、RNA和脂质体

4) EMBL-EBI数据库;javascript:;

5) ExoRBase数据库(http://www.exorbase.org/)循环RNA(CircRNA)、长非编码RNA(LncRNA)和信使RNA(mRNA)的储存库

6) 尿Exosome蛋白数据库(https:/hpcwebapps.cit.nih.gov/ESBL/Database/Exosome/)

7) ExRNA图谱数据库(javascript:;