Simoa超灵敏蛋白质检测详细

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    Simoa技术:fg级超灵敏神经因子检测服务

            
            神经系统疾病
    在其发生和发展的过程中,有多种特定的蛋白质(如NfL、Aβ40、Tau、GFAP)会透过血脑屏障进入脑脊液中,成为临床辅助诊断阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)、缺血性脑卒中(IS)、多发性硬化病(MS)等神经系统疾病的重要生物标志物。然而,抽取脑脊液会伴随巨大的痛苦和较低的患者依从度。从外周血中检测又面临新的困难,这些蛋白质会在外周血中被不同程度地清除,丰度降低数百倍,造成ELISA等常规技术很难在外周血中实现检测。



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            Simoa(Single-molecule Array)技术可以在外周血中实现这些神经系统疾病标志物的准确检测。Simoa技术是由美国Quanterix公司研发生产的一款超高灵敏度单分子蛋白质检测技术,其灵敏度为ELISA技术的1000倍以上,检测下限达到fg/mL,为血清/血浆中实时监控这些标志物提供了技术支撑,改变了脑损伤和神经退行性疾病的诊断方式。

    Simoa技术原理


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            Simoa 技术是将约250,000个捕获抗体包被在2.7 μm的小磁珠(10种荧光标记)上,检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物,通过一层油将单个磁珠封闭在4.5 μm的反应孔(Well)中进行反应(避免信号扩散和交叉反应)。每238,000个Well组成一张芯片(Array),每24个Array再组成一张光盘(Disc),Disc数据采集使用CCD摄像头捕获这些小孔中超过阈值的检测信号,标记为“on well”和“off well”。通过计算“on well”在Array中的比例,依据泊松分布理论,计算出目的蛋白的浓度,实现数字化定量,其精确度远超ELISA的模拟定量。由于磁珠经过多重荧光标记,通过计数不同颜色荧光磁珠的“on well”数量,即可同步获得多个检测指标的浓度定量值。

     

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            Simoa技术的关键原理在于:每个Well的反应体系仅为50飞升,比ELISA反应孔小20亿倍,因此,Simoa相比传统技术,不仅极大地提高酶底物的反应效率,且指数级降低了荧光信号的扩散和背景信号的干扰,从而提高了低丰度蛋白的检测灵敏度,实现了单分子检测的可能。

    Simoa技术优势


    •  高灵敏度:比传统ELISA灵敏度提高1000倍

    •  高精确度:批间变异系数(CVs)低于10%

    •  高线性范围:检测动态范围跨越4个数量级

    •  高效性:一次反应可检测24例样品中10种蛋白质

    •  独特性:拥有多种其它品牌不具备的关键指标

    •  灵活性:可通过增加样品稀释倍数解决体积限制



                                                          表1:Simoa技术的检测稳定性评价

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    Five samples consisting of three serum panels and two NF-L controls were assayed in replicates of three at two separate times per day for five days using a single lot of reagents and calibrators.

    检测指标


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            华盈生物全力打造抗体芯片、Luminex和Simoa技术的联合检测平台,全面解决神经系统疾病标志物的筛选与低丰度检出问题,为临床标志物研究、药物评价、疾病机理等生物医学研究提供系统性解决方案。


    研究案例


            Neurofilament light chain(NFL)蛋白是特异性表达于髓鞘轴突的细胞骨架成分,前期研究认为NFL阿尔兹海默病(AD)等神经退行性病变及脑损伤有显著相关性。来自德国蒂宾根大学的Oliver Preische等研究人员,通过Simoa技术系统性监测了近500例AD病人在疾病症状发生前期数年时间中NFL的表达情况。发现携带Amyloid-beta Precursor Protein (APP)和presenilin 1 /2 (PSEN1) 突变的AD患者,在发病症状记录前期(EYO)平均-6.8年即可出现脑脊液(CSF)和血清(Serum)中NFL表达升高的现象,说明NFL可以作为预判AD前期症状的重要标志物蛋白。

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            同时,该数据显示CSF与Serum中NFL表达呈现显著相关性,且Serum中NFL的平均丰度要远低于CSF。该研究于2018年发表在国际顶级期刊《Nature Medicine》上[1],充分显示了Simoa技术在监测外周血样品中NFL等低丰度蛋白研究中的不可或缺性,Simoa为疾病早期诊断提供了新的方法和可能。

    相关文献


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    3. Shi M, et al. New windows into the brain: Central nervous system-derived extracellular vesicles in blood. Prog Neurobiol. 2019 Jan 24. pii: S0301-0082(18)30106-0.  10.658

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    6. Hampel H, et al. Blood-based biomarkers for Alzheimer disease: mapping the road to the clinic. Nat Rev Neurol. 2018, 14: 639-652.  21.155

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    10. Johnson EB, et al. Neurofilament light protein in blood predicts regional atrophy in Huntington disease. Neurology. 2018;90:e717-e723.   8.055

    11. Mielke MM, et al. Plasma phospho-tau181 increases with Alzheimer's disease clinical severity and is associated with tau- and amyloid-positron emission tomography. Alzheimers Dement. 2018.  12.764

    12. Sandelius A, et al. Plasma neurofilament light chain concentration in the inherited peripheral neuropathies. Neurology. 2018.  8.055

    13. Shahim P, et al. Neurofilament light and tau as blood biomarkers for sports-related concussion. Neurology. 2018.  8.055

    14. Strydom A, et al. Neurofilament light as a blood biomarker for neurodegeneration in Down syndrome. bioRxiv. 2018.  5.015

    15. Thompson AGB, et al. Neurofilament light chain and tau concentrations are markedly increased in the serum of patients with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, and tau correlates with rate of disease progression. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 2018.  7.144

    16. Wendeln AC, et al. Innate immune memory in the brain shapes neurological disease hallmarks. Nature. 2018;556:332-338.  41.577

    17. Rissin DM, et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat Biotechnol. 2010 Jun; 28(6): 595-9.  31.864